PENGENALAN KEMBALI ALAT LABORATORIUM

Pendahuluan

Berbagai macam alat-alat laboratorium yang terbuat dari berbagai macam bahan seperti, gelas, plastik, kuarsa, sampai berbagai macam logam terdapat dalam laboratorium kimia.

Titrasi merupakan suatu metoda untuk menentukan kadar suatu zat dengan menggunakan zat lain yang sudah dikethaui konsentrasinya. Titrasi biasanya dibedakan berdasarkan jenis reaksi yang terlibat di dalam proses titrasi, sebagai contoh bila melibatan reaksi asam basa maka disebut sebagai titrasi asam basa, titrasi redox untuk titrasi yang melibatkan reaksi reduksi oksidasi, titrasi kompleksometri untuk titrasi yang melibatan pembentukan reaksi kompleks dan lain sebagainya. (disini hanya dibahas tentang titrasi asam basa) Zat yang akan ditentukan kadarnya disebut sebagai “titrant” dan biasanya diletakan di dalam Erlenmeyer, sedangkan zat yang telah diketahui konsentrasinya disebut sebagai “titer” dan biasanya diletakkan di dalam “buret”. Baik titerbmaupunbtitrantbbiasanyabberupablarutan.
PrinsiphTitrasikAsamkbasa
Titrasi asam basa melibatkan asam maupun basa sebagai titer ataupun titrant. Titrasi asam basa berdasarkan reaksi penetralan. Kadar larutan asam ditentukan dengan menggunakan larutan basa dan sebaliknya. Titrant ditambahkan titer sedikit demi sedikit sampai mencapai keadaan ekuivalen ( artinya secara stoikiometri titrant dan titer tepat habis bereaksi). Keadaan ini disebut sebagai “titik ekuivalen”. Pada saat titik ekuivalent ini maka proses titrasi dihentikan, kemudian kita mencatat volume titer yang diperlukan untuk mencapai keadaan tersebut. Dengan menggunakan data volume titrant, volume dan konsentrasintiterjmakalkitakbisalmenghitunglkadar;titrant.
CarajMengetahuilTitikkEkuivalen
Ada dua cara umum untuk menentukan titik ekuivalen pada titrasi asam basa.
1. Memakai pH meter untuk memonitor perubahan pH selama titrasi dilakukan, kemudian membuat plot antara pH dengan volume titrant untuk memperoleh kurva titrasi. Titikktengahldarifkurvahtitrasiktersebuthadalahk“titikkekuivalent”
2. Memakai indicator asam basa.

Teori Dasar
A. Definisi Titrasi Asam Basa
Titrasi merupakan suatu metode yang bertujuan untuk menentukan banyaknya suatu larutan dengan konsentrasi yang telah diketahui agar tepat habis bereaksi dengan sejumlah larutan yang dianalisis atau ingin diketahui kadarnya atau konsentrasinya. Suatu zat yang akan ditentukan konsentrasinya disebut sebagai “titran” dan biasanya diletakkan di dalam labu Erlemeyer, sedangkan zat yang telah diketahui konsentrasinya disebut sebagai “titer” atau “titrat” dan biasanya diletakkan di dalam “buret”. Baik titer maupun titran biasanya berupa larutan.
Titrasi biasanya dibedakan berdasarkan jenis reaksi yang terlibat di dalam proses titrasi, sebagai contoh bila melibatkan reaksi asam basa maka disebut sebagai titrasi asam basa atau aside alkalimetri, titrasi redox untuk titrasi yang melibatkan reaksi reduksi oksidasi, titrasi kompleksometri untuk titrasi yang melibatkan pembentukan reaksi kompleks dan lain sebagainya. (Pada laporan praktikum ini hanya dibahas tentang titrasi asam basa).

B. Prinsip Titrasi Asam Basa
Titrasi asam basa melibatkan asam maupun basa sebagai titer ataupun titrant. Kadar larutan asam ditentukan dengan menggunakan larutan basa atau sebaliknya. Titrant ditambahkan titer tetes demi tetes sampai mencapai keadaan ekuivalen ( artinya secara stoikiometri titrant dan titer tepat habis bereaksi) yang biasanya ditandai dengan berubahnya warna indikator. Keadaan ini disebut sebagai “titik ekuivalen”, yaitu titik dimana konsentrasi asam sama dengan konsentrasi basa atau titik dimana jumlah basa yang ditambahkan sama dengan jumlah asam yang dinetralkan : [H+] = [OH-]. Sedangkan keadaan dimana titrasi dihentikan dengan cara melihat perubahan warna indikator disebut sebagai “titik akhir titrasi”. Titik akhir titrasi ini mendekati titik ekuivalen, tapi biasanya titik akhir titrasi melewati titik ekuivalen. Oleh karena itu, titik akhir titrasi sering disebut juga sebagai titik ekuivalen. Pada saat titik ekuivalen ini maka proses titrasi dihentikan, kemudian catat volume titer yang diperlukan untuk mencapai keadaan tersebut. Dengan menggunakan data volume titran, volume dan konsentrasi titer maka bisa dihitung konsentrasi titran tersebut.

Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan untuk pengenalan alat dan teknik pengoperasiannya dalam proses analisis.

Prosedur Percobaan

Setiap sesi praktikum disediakan alat-alat dalam satu keranjang dengan jumlah tertentu. Inventarisasi alat-alat laboratorium dilakukan dua kali, diawal dan diakhir tiap praktikum. Kristal asam oksalat dan boraks ditimbang dengan neraca analitik dengan bobot tertentu yang setara dengan 0.1 M. Kristal hasil penimbangan dilarutkan dalam labu takar 50 ml secara tepat (pelarut:air). Dibuat juga larutan HCl 0.1 M sebanyak 50 ml dari larutan HCl dan larutan NaOH 0.1 M sebanyak 50 ml dari padatan NaOH yang tersedia. Larutan baku primer asam oksalat dipipet 10 ml dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 125 ml, ditambahkan indikator fenolftalein (pp), dititrasi dengan titran NaOH sampai terjadi perubahan warna, volume titran yang terpakai dan warna larutan pada saat tersebut dicatat. Begitu pula dengan larutan baku primer boraks dipipet 10 ml dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 125 ml, ditambahkan indikator merah metal (mm), dititrasi dengan titran HCl sampai terjadi perubahan warna, volume titran yang terpakai dan warna larutan pada saat tersebut dicatat. Standardisasi dilakukan triplo kemudian dihitung konsentrasi dari titran. Larutan HCl dipipet 10 ml dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 125 ml. Indikator jingga metil (jm) dan merah metil ditambahkan. Larutan kemudian dititrasi dengan titran NaOH sampai terjadi perubahan warna. Larutan NaOH dipipet 10 ml dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 125 ml. Indikator bromtimol biru (btb) dan fenolftalein ditambahkan. Larutan kemudian dititrasi dengan titran HCl sampai terjadi perubahan warna. Volume titran yang terpakai dan warna larutan dicatat saat perubahan warna tersebut. Titrasi dilakukan triplo untuk setiap jenis indikator yang digunakan. Konsentrasi HCl dan NaOH kemudian dihitung.

Hasil Pengamatan

Pembuatan larutan baku primer

Massa boraks yang ditimbang untuk membuat larutan boraks 0.1 M adalah

Mr Boraks = 381.2 gr/mol

M =

0.1 M =

Massa = 1.9067 gr

Massa asam oksalat yang ditimbang untuk membuat larutan asam oksalat 0.1 M adalah

Mr Boraks = 126 gr/mol

M =

0.1 M =

Massa = 0.6305 gr

Tabel 1 Standardisasi HCl dengan larutan boraks

Ulangan Volume HCl (ml) [HCl] (M)
Meniskus Awal (ml) Meniskus Akhir (ml) Volume Terpakai (ml)
1 0.3 21 21.7 0.0483
2 21 41.3 20.3 0.0493
3 0 20.3 20.3 0.0493
Rata-rata 0.0490

Reaksi                         : 2HCl + Na2B4O7 + 5H2O → 2NaCl + 4H3BO3

Perubahan warna         : merah → kuning

Indikator                     : merah metil

Perhitungan                 :

V1 x M1 = V2 x M2

20.7 ml x M1 = 10 ml x 0.1 M

M1 = 0.0483 M

Keterangan :

V1 = volume HCl

M1 = [HCl]

V2 = volume larutan boraks

M2 = [larutan boraks]

[HCl] rata-rata =  = 0.0490 M

Tabel 2 Standardisasi NaOH dengan larutan asam oksalat

Ulangan Volume NaOH (ml) [NaOH] (M)
Meniskus Awal (ml) Meniskus Akhir (ml) Volume Terpakai (ml)
1 8.4 29.4 21 0.0476
2 29.4 50.3 20.9 0.0478
3 21.5 41.8 20.3 0.0493
Rata-rata 0.0482

Reaksi                         : C2H2O4.2H2O + 2NaOH → (COONa)2 + 4H2O

Perubahan warna         : tak berwarna → merah muda

Indikator                     : fenolftalein

Perhitungan                 :

V1 x M1 = V2 x M2

21 ml x M1 = 10 ml x 0.1 M

M1 = 0.0476 M

Keterangan :

V1 = volume NaOH

M1 = [NaOH]

V2 = volume larutan asam oksalat

M2 = [asam oksalat]

[NaOH] rata-rata =  = 0.0482 M

Tabel 3

Ulangan Volume HCl (ml) [HCl] (M)
Meniskus Awal (ml) Meniskus Akhir (ml) Volume Terpakai (ml)
1 20.3 32.4 12.1 0.0405
2 32.4 42.6 10.2 0.0480
3 0 10.2 10.2 0.0480
Rata-rata 0.0455

Titran                           : NaOH

Titrat                           : HCl

Perubahan warna         : biru → kuning

Indikator                     : bromtimol biru

Perhitungan                 :

V1 x M1 = V2 x M2

12.1 ml x M1 = 10 ml x 0.0490 M

M1 = 0.0405 M

Keterangan :

V1 = volume HCl

M1 = [HCl]

V2 = volume NaOH

M2 = [NaOH]

[HCl] rata-rata =  = 0.0455 M

Tabel 4

Ulangan Volume HCl (ml) [HCl] (M)
Meniskus Awal (ml) Meniskus Akhir (ml) Volume Terpakai (ml)
1 10.2 20.3 10.1 0.0485
2 20.3 30.2 9.9 0.0495
3 30.2 40.5 10.3 0.0475
Rata-rata 0.0485

Titran                           : NaOH

Titrat                           : HCl

Perubahan warna         : merah muda → tidak berwarna

Indikator                     : fenolftalein

Perhitungan                 :

V1 x M1 = V2 x M2

10.1 ml x M1 = 10 ml x 0.0490 M

M1 = 0.0485 M

Keterangan :

V1 = volume HCl

M1 = [HCl]

V2 = volume NaOH

M2 = [NaOH]

[HCl] rata-rata =  = 0.0485 M

Tabel 5

Ulangan Volume NaOH (ml) [NaOH] (M)
Meniskus Awal (ml) Meniskus Akhir (ml) Volume Terpakai (ml)
1 0 10.2 10.2 0.0472
2 10.2 20.8 10.6 0.0455
3 20.8 31.3 10.5 0.0459
Rata-rata 0.0462

Titran                           : HCl

Titrat                           : NaOH

Perubahan warna         : jingga → merah muda

Indikator                     : jingga metil

Perhitungan                 :

V1 x M1 = V2 x M2

10.2 ml x M1 = 10 ml x 0.0482 M

M1 = 0.0472 M

Keterangan :

V1 = volume NaOH

M1 = [NaOH]

V2 = volume HCl

M2 = [HCl]

[NaOH] rata-rata =  = 0.0462 M

Tabel 6

Ulangan Volume NaOH (ml) [NaOH] (M)
Meniskus Awal (ml) Meniskus Akhir (ml) Volume Terpakai (ml)
1 31.3 41.8 10.5 0.0459
2 0.2 10.4 10.2 0.0472
3 10.4 20.7 10.3 0.0468
Rata-rata 0.0466

Titran                           : HCl

Titrat                           : NaOH

Perubahan warna         :  kuning → merah muda

Indikator                     : merah metil

Perhitungan                 :

V1 x M1 = V2 x M2

10.5 ml x M1 = 10 ml x 0.0482 M

M1 = 0.0459 M

Keterangan :

V1 = volume NaOH

M1 = [NaOH]

V2 = volume HCl

M2 = [HCl]

[NaOH] rata-rata =  = 0.0466 M

Pendahuluan

Keselamatan kerja di laboratorium sangatlah penting untuk menunjang kerja kita selama di laboratorium. Penjelasan tentang tata cara kerja di laboratorium tentunya sudah pernah didapatkan sebelumnya. Misalnya peraturan yang ada di laboratorium adalah menggunakan pelindung mata, tidak boleh bekerja sendiri dilaboratorium, harus mengenal bahan-bahan yang ada di laboratorium, tidak boleh makan dan minum, tidak boleh bekerja di laboratorium jika tidak diizinkan, mempipet larutan yang berbahaya, dan harus mengenal dengan sekitar laboratorium. Selain itu juga kita perlu mengenal cara kerja alat-alat yang akan digunakan dalam praktikum.

Sebuah pH meter adalah menstandardisasi dengan  larutan buffer untuk mengetahui pH sebelum  mengambil larutan yang belum diketahui ukurannya. Sebuah pH meter akan terdapat elektroda. Sekarang pH meter yang sering digunakan untuk mengukur pH adalah dengan menggunakan elektroda kombinasi. Penggunaan dari pH meter elektroda kombinasi relatif lebih mudah tetapi harus menggunakan petunjuk yang ada.Sehingga pemakaian alat tidak salah.

Beberapa sentrifus dapat didapatkan dengan mudah di laboratorium biokimia. Sentrifus mempunyai banyak kegunaan, akan tetapi kegunaan utama dai sebuah sentrifus adalah untuk persiapan sampel biologi dan ukuran analitik hidrodinamik. Prinsip dari sebuah sentrifus adalah gaya sentifugasi. Sentrifus di laboratorium biokimia digunakan untuk memisahkan suatu sampel.

Tujuan Percobaan

Percobaan ini bertujuan mempelajari teknik  pengoperasian dan perawatan pH meter. Selain itu juga bertujuan mempelajari teknik pengoperasian dan perawatan sentrifus

.

Alat dan Bahan

Alat yang dipakai pada percobaan pH meter  adalah pH meter, gelas piala, gelas ukur, pipet volumetrik, pipet, erlenmeyer, bulp dan gelas pengaduk. Sedangkan yang dipakai pada percobaan sentrifus adalah  sentrifus, gelas ukur, pipet volumetrik, pipet, tabung beckman, neraca timbangan, bulp dan gelas pengaduk.

Bahan yang dipakai pada percobaan pH meter adalah larutan fosfat 0.2 M dan larutan sitrat 0.1 M. Bahan yang dipakai pada percobaan sentrifus adalah suspensi kloroplas.

Prosedur Percobaan

Percobaan yang pertama adalah tentang penggunaan pH meter. Fosfat dan sitrat yang masih berbentuk padat ditimbang terlebih dahulu untuk mendapatkan konsentrasi yang sesuai. Setelah ditimbang berat keduanya lalu kedua padatan dimasukan kedalam gelas piala berbeda lalu ditambahkan 100 ml air ke dalam masing-masing gelas piala. Lalu distandardisasi terhadap pH meter. Larutan fosfat yang telah distandardisasi ditambahkan ke dalam 65 ml larutan sitrat  sebanyak 35 ml. Bila pH kurang dari 3.8 maka tambahkan fosfat dengan pipet tetes dan bila pH lebih dari 3.8 maka tambahkan larutan sitrat dengan pipet tetes.

Percobaan selanjutnya penggunaan sentrifus. Suspensi kloroplas yang tersedia diaduk sehingga tidak ada lagi yang mengendap. Tabung beckman ditimbang sehingga diketahui berat tabung tersebut. Suspensi kloroplas dimasukan kedalam tabung beckman yang telah ditimbang sebanyak 20 ml dengan menggunakan pipet volumetrik. Untuk menyimpan kedalam rotor Beckman JA-20 carilah pasangannya yang mempunyai perbedaan bobot tidak lebih dari 100 mg. Lalu keduanya ditempatkan pada rotor yang berlawanan. Rotor diputar dengan kecepatan 1200 g selama 10 menit. Setelah diputar tuangkan supernatan ke wadah yang lain. Sedangkan pellet ditimbang bobotnya.

Hasil Percobaan

Tabel 1 Bobot pelet kroloplas

Meja Tabung 1 Tabung 2
1 2.84 gr 2.18 gr 2.51 gr
2 1.98 gr 2.67 gr 2.32 gr
3 0.68 gr 1.7 gr 0.925 gr
4 2.33 gr 1.13 gr 1.73 gr

RCF                =1.2 x r (RPM/1000)2

1200                =1.2 x 10.8 cm (RPM/1000)2

1200                =12.96 (RPM/1000)2

RPM/1000       =

RPM/1000       =9.6225

RPM                =9.6225 x 1000

RPM                =9622.5

Tabel 2 Hasil standardisaai pHmeter

pH standard Hasil pengukuran
1 2
4 3.97 4.13
7 7 6.94

Tabel 3 Hasil pengamatan pH sampel

Meja pH terukur
1 3.21
2 3.89
3 3.88
4 3.03

Pembahasan

Prinsip percobaan kali ini adalah untuk mempelajari pH meter dan sentrifus sehingga dalam melakukan percobaan tidak salah dalam penggunaannya. Percobaan dilakukan dengan menghitung pH larutan yang belum  diketahui pH-nya dan kemudian dikalibrasi. Kemudian baru dihitung pH dari sebuah campuran yang tercampur. Sentrifus merupakan alat yang digunakan untuk memisahkan suatu fraksinasi subseluler.

Prinsip dari sebuah pH meter adalah alat untuk mengukur pH suatu larutan dalam suhu suatu ruangan. Sebelum pH meter digunakan harus dikalibrasi terlebih dahulu denagn larutan standar pH 4,7, dan 10. Setiap kali menggunakan pH meter harus dibilas dengan  aquades. Setelah itu pH meter dapat digunakan untuk mengukur pH sebuah campuran.

Ion buffer adalah ion yang digunakan utuk menjaga nilai suatu pH tetap konstan. Pemilihan buffer digunakan untuk memeriksa proses biokimia yang penting dan bersifat kritis. Hampir seluruh proses biokimia selalu diperiksa dengan larutan buffer. Larutan biokimia memerlukan sistem buffer. Sistem buffer yang efektif antara 6 sampai 8, namun adakalanya membutuhkan buffer yang lebih tinggi yaitu antara 2 samapi 12 (Boyer 1986).

Setiap kali mengukur pH dengan pH meter maka harus dikalibrasi terlebih dahulu dengan ph 4,7, dan 10. Hal ini dilakukan utuk mendapatkan pH yang sebenarnya dari suatu larutan.

Sentrifugasi merupakan teknik yang digunakan untuk melakukan fraksinasi subseluler (Artika & Safithri 2010). Sentrifus merupakan alat yang digunakan untuk teknik sentrifugasi. Fraksinasi subseluler adalah pemecahan sel melalui homogenasi dan pemisahan organel-organel dari jenis satu dengan jenis lainnya dengan alat sentrifus. Langkah awal dari sebuah fraksinasi subseluler adalah dengan merusak membran plasma dan dinding sel (Artika & Safithri 2010). Larutan suspensi yang telah dapat dipisahkan dengan teknik sentrifugasi. Adapun kecepatan yang digunakan untuk memisahkan larutan suspensi bisa dengan kecepatan 100.000 garafitasi. Suatu larutan yang telah dipisahkan akan terdiri dari suatu cairan dan endapan. Cairannya dinamakan dengan supernatan dan endapannya yang disebut pellet.

Ada tida jenis macam sentrifus yaitu: sentrifus benchtop, sentrifus dengan kecepatan tinggi, dan ultrasentrifus. Sentrifus benchtop digunakan untuk sentrifugasi yang kecepatannya rendah. Sentrifus dengan kecepatan tinggi contohnya Beckman. Ultrasentrifus yang canggih, alat ini digunakan untuk model persiapan dan model analitik.

Simpulan

Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa setiap alat yang ada di laboratorium mempunyai spesifikasi penggunaan masing-masing. Sehingga dalam penggunaan alat tersebut perlu keahlian. Sebuah pH meter sebelum digunakan harus dikalibrasi terlebih dahulu sehingga dapat digunakan. Kalibrasi dapat dilakukan dengan pH 4, 7 dan 10. Sentrifus berfungsi sebagai alat pemisah suatu suspensi sehingga hasil dari sentrifusnya adalah berupa supernatan dan pellet.

Daftar Pustaka

Artika I Made dan Mega Safithri.2010.Struktur dan Fungsi Subseluler.Bogor: Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor

Boyer Rodney F.1986.Modern Experimental Biochemistry.United State Of Amerika: The Benjamin/ Cummings Publishing Company

Pendahuluan

Protein adalah biopolimer yang terdiri atas banyak asam amino yang berhubungan satu dengan lainnya lewat ikatan amida (peptida). Protein merupakan makromolekul yang mengandung lebih dari 100 residu asam amino. Protein memainkan peran dalam sistem biologis. Beberapa protein merupakan komponen utama dari jaringan struktur (otot, kulit, kuku, rambut). Protein lain mengangkut molekul dari satu bagian ke bagian lain dari mahluk hidup. Masih ada lagi yang bertindak sebagai katalis dalam banyak reaksi biologis yang diperlukan untuk mempertahankan hidup. Protein juga berfungsi sebagai enzim, protein transport, protein nutrien penyimpan, kontraktil atau motil, struktural, pertahanan, pengatur, pembangun, dan aktivitas biologis.

Protein terdiri atas tiga jenis yaitu protein globular, fibrosa, dan konjugat. Protein globular yaitu protein agak bulat yang berkonfigurasi dengan struktur tersier protein. Misalnya albumin (telur), globulin (daging), histon (jaringan glandular), dan protamines (sel sperma ikan).

Protein fibrosa  yaitu protein yang tidak dapat diputus ikatannya dan yang bisa memanjang kecuali kolagen. Protein konjugat yaitu protein yang bekombinasi dengan beberapa jenis karbohidrat atau lipid kecuali glikoprotein, lipoprotein, metaloprotein, nukleoprotein, dan fosfoprotein.

Struktur protein ada tiga jenis yaitu struktur primer protein, struktur sekunder, dan tersier. Struktur primer merupakan struktur yang linier, struktur sekunder ikatan hidrogen yang membentuk helix dan strukutur tersier diesbabkan adanya ikatan hidrogen, ikatan garam, interaksi hidrofobik, dan ikatan disulfida.

Reaksi uji asam amaino sendiri terdiri atas enam macam uji yaitu: uji millon, uji hopkins cole, uji belerang, uji xantroproteat, dan uji biuret. Sedangkan untuk uji protein berdasarkan pada pengendapan oleh garam, pengendapan oleh logam, dan alkohol serta ui koagulasi dan denaturasi.

Pada uji asam amino terdapat uji bersifat umum dan uji
bersifat uji berdasakan jenis asam aminonya. Seperti halnya uji millon bersifat

spesifik terhadap tirosin, uji Hopkins cole terhadap triptofan, uji beleranng terhadap sistein, uji biuret bereaksi positif terhadap pembentukan senyawa
kompleks Cu gugus –CO dan –NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Serta uji
xantroproteat bereaksi positif untuk asam amino yang mengandung inti benzena.

Kadar protein diukur menggunakan metode Bradford dengan protein kit CBB. Kurva standar didapat dari pembacaan BSA bertingkat. Pengujian dilakukan dengan cara memasukan 10 µL sampel, 798 µL akuades dan 200 µL larutan CBB ke dalam mikrotube, kemudian digoyang pelan hingga homogen, dan selanjutnya diinkubasi dalam suhu ruang selama 15 menit. Pembacaan absorbansi dilakukan pada panjang gelombang 595 nm,karena campuran berbagai jenis protein tersebut memiliki serapan pada panjang gelombang 595 nm. Peneraan kadar protein suatu senyawa tertentu yang terdiri dari campuran berbagai jenis protein dapat dibuat berdasarkan kurva standar kalibrasi untuk suatu protein atau campuran protein target (Sudarmadji, 1995).Hasil pembacaan absorbansi sampel kemudian diplot terhadap kurva standar untuk mengetahui kadar protein total dalam sampel.

Tujuan Percobaan

Praktikum ini bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standard. Penentuan kadar protein dengan uji Bradford.

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini  adalah spektrofotometer, gelas piala, gelas ukur, pipet mohr, pipet tetes, erlenmeyer, bulp dan gelas pengaduk.

Bahan yang digunakan adalah larutan standar bovine serum albuminm (BSA), reagen Bradford, dan larutan NaCl.

Prosedur Percobaan

Pembuatan kurva standard. Penentuan kadar protein dengan metode Bradford diawali dengan membuat blanko. Siapkan 12 buah tabung reaksi. Isi ke-12 tabung dengan larutan standar BSA. Tabung 1 tidak diisi dengan BSA sedangkan untuk tabung yang lain diisi  sebanyak 10 μl untuk setiap kenaikan tabung. Tambahkan juga NaCl (μl) sebanyak 100 μl untuk tabung reaksi pertama dan untuk tabung selanjutnya dikurangi 10μl. Langkah selanjutnya ditambahkan 5 ml reagen Bradford untuk setiap tabung lalu kocok dan simpan selama 5 menit – 1 jam. Tabung 1 merupakan blanko. Kemuudian ukur dengan panjang gelombang 595 nm.

Penentuan konsentrasi protein sampel. Isi dua buah tabung reaksi dengan 100 μl larutan sampel dan ditambahkan 5 ml reagen Bradford. Cara selanjutnya sama dengan penentuan kurva standard. Baca dengan menggunakan absorban 595 nm.

Hasil Percobaan

Tabel 1 Data kurva standard BSA

Konsentrasi [ ] Absorbansi (A)
0.1 0.535
0.2 0.690
0.3 0.754
0.4 0.863
0.5 1.054
0.6 1.284

Contoh perhitungan:

Massa jenis BSA         : 1 mg/mL

Larutan 2                     : Volume BSA = 0.01 mL

Volume NaCl = 0.09 mL

Massa              = volume x massa jenis

Massa BSA     = 0.01 mL x 1 mg/0.1mL

= 0.01 mg

Gambar  1 Hubungan antara konsentrasi dan absorbansi

Tabel 2 Data konsentrasi sampel

Ulangan Absorbansi (A) Konsentrasi[ ]
1 0.815 0.0196
2 0.884 0.0196
3 0.712 0.0196
Rataan 2.411 0.0196

Massa jenis BSA         : 1 mg/mL

Ulangan 1                    : Volume BSA                        = 0.1 mL

Volume reagen Bradford      = 5 mL

Massa              = volume x massa jenis

Massa BSA     = 0.1 mL x 1 mg/mL

= 0.1 mg

Konsentrasi                 = massa/volume total

Konsentrasi BSA        =0.1 mg/5.1 mL

=0.0196 mg/ml

Pembahasan

Uji Bradford pewarna didasarkan pada keseimbangan antara tiga bentuk pewarna G Blue Coomassie kondisi. Di bawah asam kuat, pewarna yang paling stabil sebagai bentuk terprotonasi merah-dua kali lipat. Setelah mengikat protein, Namun, hal ini sangat stabil sebagai unprotonated , biru formulir.

Uji Bradford lebih cepat, melibatkan langkah-langkah pencampuran lebih sedikit, tidak memerlukan pemanasan, dan memberikan respon kolorimetri lebih stabil daripada tes yang dijelaskan di atas. Seperti tes lainnya, namun, respon yang rentan terhadap pengaruh dari sumber non protein, khususnya deterjen, dan menjadi semakin lebih nonlinier pada akhir tinggi konsentrasi berbagai protein yang berguna, The. respon juga tergantung dan bervariasi protein dengan komposisi protein.  keterbatasan ini membuat protein solusi standar yang diperlukan.

Komposisi reagen Bradford Reagen uji dibuat dengan melarutkan 100 mg Coomassie Blue G250 di 50 mL etanol 95%. Solut  tersebut kemudian dicampur dengan 100 mL asam fosfat 85% dan disusun sampai dengan 1 L dengan air suling.

Uji Bradford suatu prosedur sederhana untuk penentuan konsentrasi protein dalam larutan adalah Bradford protein assay yang digambarkan pertama oleh Bradford. Sebuah estimasi konsentrasi protein penting untuk dilakukan dengan cepat dan akurat dalam berbagai bidang studi protein.  Uji Bradford telah menjadi pilihan metode untuk mengukur banyak protein di laboratorium. Teknik ini sederhana, cepat, dan lebih sensitif dibandingkan dengan metode Lowry. Selain itu, bila dibandingkan dengan metode Lowry, adalah kurang terganggu oleh reagen umum dan komponen nonprotein sampel biologis.

Uji Bradford mengandalkan pengikatan dye Coomassie Blue G-250 terhadap protein. Detil studi menunjukkan bahwa pewarna bebas dapat berada dalam empat bentuk ion yang berbeda untuk nilai pKa adalah 1,15, 1,82, dan 12,4. Dari tiga bentuk dibebankan dari pewarna yang mendominasi dalam larutan reagen uji asam, bentuk-bentuk merah dan hijau lebih kationik memiliki absorbansi maksimum pada 470 nm dan 650 nm, masing-masing. Sebaliknya, bentuk biru anionik lebih dari pewarna, yang mengikat protein, memiliki absorbansi maksimum pada 590 nm.

Dengan demikian, jumlah protein dapat diperkirakan dengan menentukan jumlah zat pewarna dalam bentuk ionik biru. Hal ini biasanya dicapai dengan mengukur absorbansi larutan pada 595 nm.

Pewarna muncul untuk mengikat paling mudah untuk arginil dan residu lisil protein. Kekhususan ini dapat mengakibatkan variasi respon uji untuk protein yang berbeda, yang merupakan kekurangan utama dari metode ini. Uji Bradford asli menunjukkan variasi yang besar dalam respon antara protein yang berbeda.  Beberapa modifikasi untuk metode telah dikembangkan untuk mengatasi masalah ini.

BSA digunakan untuk menstabilkan beberapa enzim pencernaan pada DNA dan mencegah adhesi enzim untuk tabung reaksi dan kapal lainnya. Ini protein lain tidak mempengaruhi enzim yang tidak perlu untuk stabilisasi. BSA juga biasa digunakan untuk menentukan jumlah protein lain, dengan membandingkan kuantitas yang tidak diketahui jumlah protein untuk diketahui BSA. BSA digunakan karena stabilitas, kurangnya efek dalam reaksi biokimia banyak, dan biaya rendah sejak jumlah besar dapat dengan mudah dimurnikan dari darah sapi, produk sampingan dari industri ternak. NaCl digunakan sebagai pereaksi.

Kurva standar digunakan untuk mengetahui kenaikan absorbansinya. Selain itu juga digunakan untuk mengetahui persamaan garis linier sehingga terlihat dengan jelas.

Pada percobaan pembuatan kurva standar menggunakan blanko uang berfungsi untuk menghitung berapa nilai dari transmitran atau absorban jika tidak dihitung blankonya maka inti sampel absorbannya makin besar. Maka didapatkan nilai absorbansi yaitu 0.535, 0.690, 0.754, 0.863, 1.051, dan 1.284. Kenaikan absorbansi ini juga seiring dengan kenaikan konsentrasi dari BSA-nya. Jadi, semakin tinggi konsentrasi semakin tinggi absorbansinya.

Pada percobaan penentuan konsentrasi pada protein sampel menggunakan konsentrasi yang sama yaitu sebesar 0.0196 mg/mL. Pada konsentarasi yang sama ini didapatkan absorban yang tidak terlalu jauh.  Nilai absorbansi yang didapatkan yaitu 0.815, 0.884, dan 0.172.

Simpulan

Hasil praktikum pembuatan kurva standar yang menggunakan blanko dapat dihasikan bahwa semakin besar nilai konsentrasi dari BSA maka akan semakin besar absorbansinya. Kurva yang terbentuk pun akan meningkat dengan besar persamaan garisnya adalah y = 1.413x + 0.368 dan R² = 0.962. Sedangkan untuk penentuan konsentrasi protein sampel menggunakan konsentrasi yang sama yaitu 0.0196 mg/mL. Nilai absorbansi yang didapat tidak terlalu jauh.

Daftar Pustaka

Hart Harold, Leslie E. Craine, David J. Hart. Kimia Organik. Edisi ke-11. Amerika Serikat:  Michigan State University

Wijaya Hanny C, Feri Kusnandar, Slamet Budijano, Didah Nur Faridah. 2009. Pengantar Kimia Pangan. Bogor: Bagian Kimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Institut Pertanian Bogor

Nasoetin Amini, Evy Damayantini, editor. 2008. Diktat Ilmu Gizi Dasar. Bogor: Departemen Ilmu Gizi, Fakultas Ekologi Manusia, Institut Pertanian Bogor